熒光定量PCR簡介
熒光定量PCR檢測技術(shù)誕生至今已10多年的時(shí)間，而其應(yīng)用一直都沒廣泛展開，究其原因，無外乎受制于相關(guān)儀器、試劑和技術(shù)的發(fā)展。近期，尤其是08年以來，儀器和試劑是遍地開花，這也使科研人員均躍躍欲試，都想借此技術(shù)使自己的研究能突飛猛進(jìn)，發(fā)展勢頭通過查找每年所發(fā)表的文章數(shù)可一目了然。據(jù)有關(guān)統(tǒng)計(jì)，在 Medline 數(shù)據(jù)庫中，用“Taqman” 或 ”real time PCR” 作為關(guān)鍵詞檢索，1996 年是19 篇，1999 年157 篇，到2003 年就高達(dá)2984 篇，2009年會(huì)是多少呢？我們不得而知。但其迅猛的發(fā)展勢頭卻是不可更改的，本公司真誠希望能和眾多研究人員共同努力，抓住這一大好時(shí)機(jī)，為科研事業(yè)的發(fā)展貢獻(xiàn)自身的力量。基于這一目標(biāo)，本公司長期以來對熒光定量PCR，無論是技術(shù)還是多年來的產(chǎn)品，均進(jìn)行了深入地研究，并及時(shí)推出更加優(yōu)異的熒光定量 PCR技術(shù)服務(wù)。
熒光定量PCR原理
熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。
一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值（如下圖所示）。
熒光域值（threshold）
是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般熒光域值的缺省設(shè)置是PCR反應(yīng)前3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold。
Ct 值：是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
Ct值與起始模板的關(guān)系：
研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值如下圖所示。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
熒光定量檢測
熒光定量檢測根據(jù)所使用的標(biāo)記物不同可分為熒光探針和熒光染料。熒光探針又包括Beacon技術(shù)（分子信標(biāo)技術(shù)，以美國人Tagyi為代表）、 TaqMan探針（以美國ABI公司為代表）和FRET技術(shù)（以羅氏公司為代表）等；熒光染料包括飽和熒光染料和非飽和熒光染料，非飽和熒光染料的典型代表就是現(xiàn)在最常用的SYBR GreenⅠ；飽和熒光染料有EvaGreen、LC Green等。
嵌合熒光染料法（SYBR GreenⅠ）
SYBR Green I是熒光定量PCR最常用的DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA非特異性結(jié)合。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合，其熒光增加1000倍。所以，一個(gè)反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號(hào)與出線的雙鏈DNA量呈比列，且會(huì)隨擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而增加。
SYBR Green I熒光染料與DNA雙鏈的結(jié)合
雙鏈DNA結(jié)合染料的優(yōu)點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡單，僅需要2個(gè)引物，不需要設(shè)計(jì)探針，無需設(shè)計(jì)多個(gè)探針即可以快速檢驗(yàn)多個(gè)基因，且能夠進(jìn)行熔點(diǎn)曲線分析，檢驗(yàn)擴(kuò)增反應(yīng)的特異性，低的初始成本，通用性好，因此國內(nèi)外在科研中使用比較普遍。
熒光探針法（Taqman 技術(shù)）：PCR擴(kuò)增時(shí)，加入一對引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)，探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，PCR 儀檢測不到熒光信號(hào)； PCR擴(kuò)增時(shí)（在延伸階段），Taq 酶的 5' － 3' 切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條 DNA 鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與 PCR 產(chǎn)物形成完全同步，這也是定量的基礎(chǔ)所在。其過程如下圖所示
熒光定量PCR的應(yīng)用
分子生物學(xué)研究
1.核酸定量分析。 對傳染性疾病進(jìn)行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的檢測 , 比如近期流行的甲型H1N1流感， 轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物基因拷貝數(shù)的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等。
2.基因表達(dá)差異分析。 比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異 ( 如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等 ) ，特定基因在不同時(shí)相的表達(dá)差異以及cDNA芯片或差顯結(jié)果的確證。
3.SNP 檢測。檢測單核苷酸多態(tài)性對于研究個(gè)體對不同疾病的易感性或者個(gè)體對特定藥物的不同反應(yīng)有著重要的意義，因分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)的巧妙性，一旦SNP 的序列信息是已知的，采用這種技術(shù)進(jìn)行高通量的 SNP 檢測將會(huì)變得簡單而準(zhǔn)確。
4.甲基化檢測。甲基化同人類的許多疾病有關(guān)，特別是癌癥， Laird 報(bào)道了一種稱作 Methylight的技術(shù)，在擴(kuò)增之前先處理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物和 Taqman探針來區(qū)分甲基化和非甲基化的 DNA ，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。
醫(yī)學(xué)研究
5.產(chǎn)前診斷：人們對遺傳性物質(zhì)改變引起的遺傳性疾病還無法治療，到目前為止，還只能只能通過產(chǎn)前監(jiān)測，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發(fā)生，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測其Y性別決定區(qū)基因是一種無創(chuàng)傷性的方法，易為孕婦所接受。
6.病原體檢測：采用熒光定量PCR檢測技術(shù)可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結(jié)核分枝桿菌、EB病毒和巨細(xì)胞病毒等病原體進(jìn)行定量測定。與傳統(tǒng)的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優(yōu)點(diǎn)。
7.藥物療效考核：對乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析顯示：病毒量與某些藥物的療效關(guān)系。HCV高水平表達(dá)，干擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，干擾素作用敏感；在拉米夫定治療過程中，HBV- DNA的血清含量曾有下降，隨后若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發(fā)生變異。
8.腫瘤基因檢測：盡管腫瘤發(fā)病的機(jī)理尚未清楚，但相關(guān)基因發(fā)生突變是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達(dá)增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現(xiàn)。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以準(zhǔn)確檢測癌基因的表達(dá)量。目前用此方法進(jìn)行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細(xì)胞性白血病WT1基因、腫瘤 ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關(guān)的病毒基因等多種基因的表達(dá)檢測。